B6-Klhl22tm1小鼠,動物試驗

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基本信息

品系名稱：B6-Klhl22^tm1小鼠

英文名稱：B6-Klhl22^tm1 mouse

疾病名稱：假性醛固酮減少癥Ⅱ型、癌癥、衰老

相關基因：Klhl22

背景品系：C57BL/6J

遺傳類型：基因敲除

繁殖方式：HOM X HOM

繁殖代數：NA

研究用途：用于研究假性醛固酮減少癥Ⅱ型、癌癥、衰老等及信號轉導方面的研究。

飼養環境：屏障或隔離環境

培育單位：北京華阜康生物科技股份有限公司、中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

保種單位：中國醫學科學院醫學實驗動物研究所

資源鑒定：否

鑒定日期：暫無介紹

特征描述

KLHL 的結構及基本功能

KLHL 基因家族，是編碼 BTB / POZ 結構域和 Kelch 結構域超家族交叉點處構成亞組的蛋白質的一組基因。其最早發現于痘病毒中。通常具有 BTB / POZ結構域，BACK 結構域和 5-6 個 Kelch 基序。BTB 的命名來源是基于果蠅的一百多個氨基酸構成的同源結構域。在人類的進化歷史進程中，那些具有 BTB結構域的鋅指蛋白是相對不變的，截止到現在人類 KLHL 基因已經超過 49 個成員。BTB 結構域的主要功能是促進蛋白質的結合和二聚化。POZ 結構域的命名則是基于鋅指蛋白和痘病毒蛋白的末端中存在的 120 個氨基酸基序而來。Kelch 重復序列或結構域同樣在進化過程中一直是相對保守的結構，Kelch 結構的β-螺旋結構包括四個β-折疊，其可以細劃分為五個亞組。①螺旋蛋白②N-螺旋蛋白③C-螺旋蛋白質④N-螺旋，C-螺旋二聚體蛋白，⑤N-二聚體，C-螺旋蛋白。Kelch 結構域形成β-螺旋體的三級結構，其在細胞外功能、形態和與其他蛋白質的結合中起作用。至于 KLHL 家族成員的 BACK 結構域，是一個在 BTB-Kelch蛋白中觀察到的 130 個殘基保守區。BACK 結構域沒有明確的已知功能，但其重要性不可忽視，因為該結構域中的突變與多種疾病的發現息息相關。BTB 超家族含有 KLHL，KBTBD 和 KLHDC 三個亞家族，這三個亞家族在三個結構域的數量組成不同。KLHL 蛋白由一個 BTB / POZ 結構域，5-6 個 Kelch基序和一個 BACK 結構域構成；KBTBD蛋白則通常包含一個 BTB / POZ 結構域，2-4 個 Kelch 基序，偶爾具有 BACK 結構域；KLHDC 只含有 3-7 個 Kelch 基序，通常沒有 BTB 和 BACK 結構域。基因命名委員會（HGNC）在人類基因組中定義了 42 個 KLHL 基因，它們各自分布在不同的染色體上。人類的很多疾病與KLHL 家族有關。

KLHL 在疾病中的作用

KLHL3 的降低與假性醛固酮減少癥Ⅱ型（PHAII）有關

假性醛固酮減少癥Ⅱ型（PHAII）是一種遺傳性高血壓疾病，其特征為高鉀血癥，代謝性酸中毒和噻嗪類敏感。編碼WNK激酶（WNK1 和 WNK4）的基因與 PHAII 的發展有關。許多體外和體內研究已經證明了包含 WNK 激酶，氧化應激反應 1（OSR1），Ste20 相關的富含脯氨酸- 丙氨酸的激酶（SPAK），Na-Cl協同轉運蛋白（NCC）和 Na-k-Cl 協同轉運蛋白（NKCC）參與的信號級聯。WNK激酶磷酸化并激活 OSR1 / SPAK，后者又直接磷酸化和激活 SLC12A 轉運蛋白（NCC，NKCC1 和 NKCC2）。

腎臟中這種信號級聯的異常激活是 PHAII 的分子基礎。最近，Kelch-like3（KLHL3）和 cullin3（CUL3）也被鑒定為 PHAII 的負責基因。CUL3 是一種 cullin-RING 連接酶家族蛋白，形成泛素 E3 連接酶復合物，在泛素依賴性蛋白質降解中起關鍵作用。CUL3 通過其 bric-Abrac / tramtrack / broad complex（BTB）結構域與 KLHL3 相互作用。KLHL3 與 WNK 激酶的酸性基序結合，作為基于 CUL3 的 E3 連接酶介導的泛素化的底物銜接蛋白起作用。CUL3-KLHL3E3 連接酶復合物泛素化 WNK1 和 WNK4，導致其降解，并且 PHAII 的常見病因之一是由于 CUL3-KLHL3 E3 連接酶復合物損傷導致 WNK 激酶的缺陷降解，導致 WNK 激酶的蛋白質豐度增加和 WNK 信號傳導的激活。

已知在 CUL3 中引起 PHAII 的突變聚集在外顯子 9 周圍，而還有一些位于內含子 8 的剪接受體位點內，導致外顯子 9 跳躍和具有 57 個氨基酸 CUL3 蛋白質的缺失（Δ403-459）。缺乏外顯子 9 的突變體 CUL3 的病理生理學機制已經被研究過。據報道，由于 KLHL3 泛素化增加，突變體 CUL3（Δexon9）顯著降低了體外 KLHL3 的表達。因此，KLHL3 的蛋白質豐度是否真正受到 CUL3 突變的影響仍存在爭議。

PHAII 的一個關鍵特征是主要的表型異常，如高鉀血癥和代謝性酸性，通過給予噻嗪類利尿劑來糾正，噻嗪類利尿劑是 NCC 的特異性抑制劑，因為 NCC的過度激活在該疾病中起重要作用。對于與 CUL3 突變相關的 PHAII 也是如此。PHAII 的主要特征包括高血壓，嚴重代謝性酸中毒和電解質紊亂，目前已發現幾種 CUL3 底物銜接子，即 KLHL 家族蛋白，它們的泛素化在各種細胞過程和疾病狀態中起關鍵作用。 另外，CUL3 突變患者的發育障礙并不明顯。這些事實意味著引起 PHAII 的 CUL3 突變可能以特定方式影響 WNK 信號級聯反應，KLHL3 在 PHAII 中起著重要的作用。

KLHL5 敲低會增加細胞對抗癌藥物的敏感性

雖然 KLHL5 的全部功能尚未闡明，但已有研究表明 KLHL 與包括 Aurora B和 PLK1 在內的細胞周期調節因子存在密切聯系。KLHL5 在卵巢，腎上腺和甲狀腺組織中表達相對較高，它還在人類胎兒腦組織中天然表達剪接變體。針對靶向 KLHL5 可能提供另一種調節細胞周期活動的方法，這是一種流行的抗癌策略，提示其用 Barasertib 等抑制劑單獨治療的臨床潛力，或在組合療法中用于克服耐藥性或治療難治性疾病的能力。Deshmukh 等人最近已經提出了將 KLHL 家族成員 KEAP1 作為癌癥和神經退行性疾病的治療靶點的潛力，因為它與 NRF2 途徑相關。此外，Shibata 等人提出了 KEAP1 突變直接影響膽囊癌的化療耐藥，而作為 KLHL 家族的成員，KLHL5 同樣影響藥物敏感性，及對治療的反應和化療耐藥。首先 KLHL5 表達與許多化合物的藥物敏感性降低相關，在 NCI 數據集中約 20,000 種抗癌化合物中，超過 1600 種化合物在藥物作用和 KLHL5 表達之間的負相關性小于-0.400,大量負相關化合物表明幾種化合物對具有較高 KLHL5 表達的細胞系傾向于較低效力。Robert J.等還發現 KLHL5 的敲低減少癌細胞增殖，其敲低與細胞周期抑制劑及 Akt/PI3K/ mTOR 抑制劑協同作用。表明 KLHL5 敲低會增加細胞對抗癌藥物的敏感性，這將為有可能成為新型的癌癥治療靶點。

KEAP1（KLHL19）的糖基化將營養傳感與氧化還原應激信號聯系起來

KEAP1 也稱為 KLHL19，其糖基化將營養傳感與氧化還原應激信號聯系起來。NRF2 是一種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，其水平和活性在無應激狀態的細胞中被 KEAP1 抑制，后者是 Cullin-3（CUL3）依賴性 E3 泛素連接酶復合物的底物銜接蛋白。KEAP1-CUL3 通過介導其泛素化和隨后的蛋白酶降解來抑制NRF2。氧化應激或親電試劑修飾 KEAP1 中的半胱氨酸殘基，導致其構象變化，且結合的 NRF2 的泛素化減少。因此，在這種條件下，新翻譯的 NRF2分子保持不含有 KEAP1，從而允許 NRF2 積累和核轉位。

在細胞核中，NRF2 結合含有抗氧化應答元件（ARE）DNA 序列的啟動子，激活參與氧化應激反應的許多基因的轉錄，如血紅素加氧酶 1（HO-1），超氧化物歧化酶（SOD），NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO1），γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCS）和谷胱甘肽還原酶。NRF2 調節的 ARE 驅動基因的表達，特別是涉及谷胱甘肽（GSH）生物合成和再循環的基因，對于各種疾病模型中氧化應激期間的細胞存活至關重要。

幾種關于調節 NRF2 途徑的幾種機制已經被研究過。例如 ，氧化應激或親電子異 生 素要么破壞KEAP1-NRF2 要么破壞KEAP1-CUL3 的相互作用，從而減少 NRF2 泛素化和降解，并激活 NRF2靶標的下游轉錄。此外，NRF2 途徑受 PTM 的調節，包括 KEAP1 的琥珀酸化和 NRF2 本身的磷酸化。使用對 OGT 抑制的轉錄反應作為指導，顯示出KEAP1 在絲氨酸 104 處的 O-GlcNAc 化需要抑制未受應激細胞中的 NRF2 途徑。KEAP1 通過其 BTB 結構域和部分干預區（IVR）結構域與 CUL3 結合而 KEAP1Kelch 基序與底物相互作用，KEAP1 和 CUL3（但不是 KEAP1 和 NRF2）之間的相互作用受到 S104 的 KEAP1 的 O-GlcNA 化的影響。KEAP S104 的 O-GlcNA化需要通過增強 KEAP1 與 CUL3 結合，或優化的 KEAP1 構象來實現與 CUL3的有效相互作用和其底物的有效泛素化。KLHL19 在氧化應激信號中具有重要的意義【2】。

北京大學分子醫學研究所/北大-清華生命科學聯合中心劉穎課題組在Nature雜志上發表了題為KLHL22 activates amino-acid-dependent mTORC1 signalling to promote tumorigenesis and ageing的論文，圍繞GATOR1對mTORC1的抑制是如何被解除這一重要科學問題進行了闡述。研究表明，GATOR1復合物的關鍵亞基DEPDC5的蛋白穩定性受CUL3-KLHL22泛素連接酶調控，揭示了KLHL22對mTORC1的重要調控作用，并且該調控機制在物種中具有高度保守性。此外，該研究還通過小鼠腫瘤模型證明了KLHL22是一個通過激活mTORC1起作用的致癌基因，同時也是乳腺癌的一個潛在的治療靶點。

在闡明KLHL22除了在調控長壽方面的功能之后，研究人員又通過公開的數據庫Oncomine發現在多種乳腺癌細胞系中KLHL22的表達水平相比于正常組織是顯著升高的，進一步通過和北大腫瘤醫院合作發現拿到的所有乳腺癌病人的腫瘤樣品中KLHL22都高表達，相應的DEPDC5（GATOR1復合物的關鍵亞基）表達下降，然后通過系列實驗證明了在乳腺癌細胞系中敲除KLHL22后能夠抑制氨基酸激發的DEPDC5蛋白的降解，當然最終的機構也是抑制了腫瘤細胞的生長【1】。

還有報道指出KLHL22 m RNA在膀胱癌中表達量較正常膀胱相對較高;實時定量PCR和Western blot也顯示KLHL22在膀胱腫瘤組織中m RNA和蛋白質的表達水平明顯高于對照組;Ed U細胞增殖實驗、劃痕實驗和transwell侵襲實驗顯示KLHL22可以促進膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲【2】。

動物簡介

營養成分

生物學特性

實驗儀器

測試流程

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